作为一种常见病、多发于中晚期的消化道恶性肿瘤，食管癌多为发病隐匿、诊断，使得许多病人在手术前后都需要进行化学治疗，以保证手术效果，而化疗又给许多失去手术机会的病人提供了治疗机会。被称为Taxol的紫杉醇最初是Wall和Wani在1963年从太平洋红豆杉的皮中提取的[1]，经过临床试验，近几年已被广泛用于临床各种肿块，包括食管癌。

肿瘤的化疗。在凋亡受体途径中，紫杉醇可能作用于Fas/FasL途径，或活化凋亡启动途径的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶系统(caspases)，FADD是Fas/FasL凋亡体系中的重要分子[2,3]；除了参与凋亡过程外，还参与细胞周期调控。实验[4]证实FADD蛋白和mRNA在食管正常粘膜和非典型增生组织中的表达呈明显下降趋势。临床研究[5,6]提示紫杉醇联合顺铂、氟尿嘧啶等药物治疗食管癌，可提高食管癌的总有效率，但毒副作用不显著增加，病人耐受性良好，说明紫杉醇在食管癌治疗中具有较高的临床应用价值。在G2-M期，紫杉醇能显著抑制人食道癌细胞的生长，使其在G2-M期被阻断，诱导肿瘤细胞凋亡。但是，目前的研究还未发现FADD在这一过程中表达的改变情况。

采用紫杉醇诱导人食管鳞癌Ec-109细胞凋亡的方法，测定细胞FADD蛋白表达的变化，探讨紫杉醇诱导人食管癌细胞增殖的分子机制，为临床应用提供实验依据。

1物质与方法。

1.1试剂和药泰素(百时美施贵宝公司惠供6g/L、分子质量8539u)，用RPMI1640培养液.005%胰酶和小牛血清作为高锰酸钾制剂，AnnexinV(FITC)/PI凋亡检测试剂盒购入杭州隆基生物工程研究所，蛋白质萃取液收购于Pierce公司，兔抗人FADD单克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体购于SantaCruz公司，本公司采购的考马斯亮蓝试剂盒在南京建成生物科技有限公司。

1.2上海麦莎生物科技有限公司是一家以细胞培养的人食管癌细胞株Eca-109(ATCC)为公司代购。将该细胞接种到含有10%小牛血清的RPMI1640培养液，在37℃CO2培养箱中培养，细胞生长至对数生长阶段，然后进行对数生长试验。将胰酶消化细胞后的培养基悬置，将调节细胞数5×10.5/ml接种到6孔培养板中，在24小时后更换新鲜培养液，同时在实验组的培养液中添加到5.10.20.50nmol/L泰素，对照不用药物，每个浓度设3个复孔，24h培养后采集所有细胞。

1.3检测凋亡。

采集各组细胞后，用PBS洗涤离心，细胞重悬于300μbandingbuffer内，添加5μlAnnexinV-FITC，室温避光孵化15min，然后加入5μlPI，细胞凋亡率在室温避光5min，上流式细胞仪测定，并以不加AnnexinV-FITC和PI的一管为对照。

分别采集各组细胞，PBS清洗离心后，加入含有蛋白酶抑制剂的蛋白提取液，在100℃煮沸变性后，加入含有蛋白酶抑制剂的蛋白提取物，并在100℃下进行煮沸变性。用SDS-PAGE电泳，半干转膜，取适量的蛋白质，抗人FADD单克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体按1:1000孵化，过夜后在4℃下洗膜，分别以1:1000孵化羊抗兔和羊抗鼠二抗、洗膜、显影、显影后的图像分析和数据采集。

1.5统计方法。

上述试验全部重复进行3次，实验数据用SPSS130软件分析处理，t检验统计方法为t检验，组间比较采用单因素方差分析，P<005显示差异有显著性。

2结果

在人食管癌细胞株Eca-109中，通过对紫杉醇诱导凋亡率的测定，观察到实验组凋亡率明显高于对照组，而治疗组在5nmol/L和10nmol/L的紫杉醇药物浓度没有显著性差异，在20nmol/L和50nmol/L两种情况下，细胞凋亡率明显升高；5nmol/L及10nmol/L与图1中存在显著性差异。

通过对22个细胞FADD蛋白的检测，发现Eca-109细胞的FADD蛋白表达水平明显高于对照组，见图2,a。细胞在20nmol/L和50nmol/L组中只有紫杉醇药物的浓度有明显的表达。

FADD蛋白水平与对照组有显著差异，如图2,b。

3讨论

在紫杉醇浓度达20nmol/L和50nmol/L时，紫杉醇对人食管癌细胞株Eca-109细胞发生凋亡有明显的抑制作用。研究结果表明，只有紫杉醇在一定的血药浓度下才能对食管癌细胞产生抗肿瘤作用。紫杉醇含量低可能仅抑制细胞增殖，但不一定能导致食管癌细胞凋亡。FADD是FAS受体家族的一员，在TNF死亡受体家族的一员，在信号通路中介导细胞死亡信号连接蛋白。DD在其羧基末端和Fas细胞浆段DD之间的结合，Fas和FasL结合可激活Fas胞胞内死亡域形成三聚体，并使FADD的构象发生变化，聚集Caspase-8前体，断裂和活化，形成活性Caspase-8，由此引发一系列下游Caspase-3反应，诱导细胞凋亡[8]。实验表明，紫杉醇诱导的人食管癌细胞株Eca-109细胞凋亡时，FADD蛋白表达明显增高，低浓度组与对照组相比无显著差异。提示紫杉醇可能通过Fas/FasL途径进行食管癌的治疗，其可诱导食管癌细胞FADD表达水平升高，加速细胞凋亡。研究还表明，在抗肿瘤治疗中，剂量紫杉醇也是关键。

食管肿瘤的治疗是一项综合性的治疗过程，化疗只是其中之一。尽管紫杉醇已在临床上显示了一定的疗效，但它仍然不能完全改变食管癌疾病的预后。同时，笔者仅选取食管癌中的鳞癌细胞株进行研究，并不能代表食管癌的全部病理类型，希望能够对此提供更多有价值的理论依据。