胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤，其发病率在世界恶性肿瘤中排名第二，其发病机制尚不十分清楚。大多数学者认为，胃癌的发生是物理、化学、生物和其他多因素。多阶段的发展过程。1990年，Burke等[1]首次报道了一例EBV阳性胃癌此后，EBV感染与胃癌的关系引起了人们的关注[2]。EBV最初是由Epstein和Barr从非洲伯基特淋巴瘤（BL）中发现的，这与各种人类肿瘤有关。目前，对EBV胃癌的研究主要是临床病理学，但EBV感染后胃上皮细胞变化的分子机制尚不清楚。作者利用EBV感染和PAR-2基因转染体外培养的胃上皮细胞系GES-1，对细胞生物学特征的变化进行了比较和分析，探讨了PAR-2基因在EBV胃癌发展中的作用。

1材料及方法。

1.1主要试剂脂质体LipofectAMINETM2000regent，G418从Invitrogen公司购买；小量质粒提取试剂盒。限制性内切酶。XDNA/Hindmmaker，200byDNAstepladder。琼脂糖从华美生物技术工程公司购买；RPMI1640培养基从美国Gibco公司购买；胎牛血清(FCS)从基因公司购买；免疫细胞化学染色试剂盒从北京中杉金桥生物技术有限公司购买；胃癌患者血清来自我院肿瘤科；载体及细胞株:pcDNA3空载体质粒。pcDNA3-c-myC重组质粒和携带NEW基因的重组EBV产生细胞系Akata1061由南方医科大学肿瘤研究所提供；大肠杆菌HB101由安必平生物技术有限公司提供。

1.2细胞培养人胃上皮细胞系GES-1采用RPMI1640培养基，含有10%FCS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素，在37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞每2~3天换一次液，细胞融合约80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。Akata细胞是具有G418抗性的悬浮淋巴细胞。传统的悬浮细胞培养方法还包括700mg/LG418。

1.3PCDNA3-PAR-2重组质粒和PCDNA3空载体质粒获取感觉态大肠杆菌，按质粒小量提取法提取纯化质粒DNA，用BamHI酶切割电泳鉴定，用Quantityone图像分析软件测定灰度，计算提取质粒浓度，并根据浓度确定转染所需量。

1.4基因转染和阳性克隆筛选将PCDNA3-c-myc重组质粒和PCDNA3空载体质粒按1:2~1:3的量用脂质体法转染24孔板中90%~93%融合的GES-1细胞，按试剂盒操作手册进行。37℃转染5小时后，加入FCS，最终浓度为10%。48小时后，阳性克隆采用有限稀释法进行，放置在选定的培养基中，含有300mg/LG418(根据预测实验结果)，筛选培养2周。当抗性单克隆长到足够大时，选择单克隆集落，扩大培养，制备细胞片。EBV感染和阳性克隆筛选:感染前3天，Akata1061细胞稀释至2×103/ml，最终浓度为0.5%的山羊抗人降解血清，37℃培养2小时，不时轻轻摇动，然后用PBS洗两次，继续培养含10%FCS的RPMI1640培养基。感染前一天，将GES-1细胞用2mol/LEIYI'a/PBS消化，放入12孔培养板中，每孔2ml培养基，含5×103细胞。体积培养基换等体积培养基。转染时，每孔加入1mlakata细胞悬液，在37℃和5%的CO2培养箱中共同培养3天。第二天更新一半的培养基，将FCS浓度降至5%。过程结束后，用PBS洗4次，加入2ml，含10%FCS培养基。感染后第五天，细胞被消化，稀释到2×102/ml，然后在96孔板中接种，直到克隆形成。在此过程中，在培养基中加入G418，最终浓度为300mmol/L，最终浓度为1mmol/L的更昔洛韦(仅第一周)。定期培养和制备细胞片。

1.5EBNAL和PAR-2蛋白检测用FTIC标记的免疫细胞化学方法检测EBNAI的表达；感染和转染细胞片检测PAR-2蛋白的表达。免疫细胞化学检测方法按说明书操作，以PBS代替抗体作为阴性对照，以细胞内明显的亮绿色判断为阳性结果。

1.6细胞生长曲线测定EBV感染。c-myc基因转染和对照细胞培养到对数生长期，用0.25%胰酶消化制成单细胞悬浮液。计数后，在24孔板上接种3×103个/孔，每孔加人无血清培养基2ml培养1天使细胞同步含10%FCS的RPMI1640培养基2ml代替继续培养。每天取4孔进行细胞计数，每孔重复计数3次，取其平均值，连续计数7天，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.7软琼脂克隆试验在6孔细胞培养板中，每孔加入0.66%底琼脂3ml(1.5ml1.3%琼脂冷却至55℃左右，与1.5ml预温37℃含2×RPMI1640培养基混合)。凝固后，加入0.33%含细胞的上琼脂3ml，每组细胞进行复孔。在37℃、5%CO2和饱和湿度下培养2~3周，观察软琼脂中细胞集落的形成。

1.8细胞周期的测定分别收集每组细胞，用0.25%胰酶消化，离心收集细胞，用冷PBS洗两次。加入70%的预冷酒精，4℃过夜。800~1000×g离心弃上清，冷PBS离心洗两次并重悬浮，制成单细胞悬浮液。注意离心速度不要太快。当体积细胞悬浮液与碘化丙啶(PI)染液混合时，将20min×300目尼龙过滤放置在4℃，并将样品加入流式细胞分析仪样品室进行细胞周期检测。

1.9统计处理采用SPSS13.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析。设置P0.05为差异。

2结果

2.1PWNA3-PAR-2重组质粒鉴定扩增纯化的PCDNA3-PAR-2重组质粒通过BamHI酶切割。电泳显示，PAR-2基因大小为1.3kb，PCDNA3载体为5.4kb，正好在PCDNA3的BamHI位点，与提供的质粒图谱一致(图1)和PAR-2蛋白表达，转染PAR-2基因的GES-1细胞具有PAR-2蛋白表达，细胞均染成亮绿色，阳性结果主要出现在细胞核中，部分在细胞质中，而空载体转染组和正常GES-1细胞均为阴性(图2.图3)。

2.2细胞形态学变化正常的GES-1细胞呈短梭形，大小一致，核小为圆形或椭圆形；感染和转染组细胞体积较大，呈椭圆形或多角形，核变大，核浆比增大，折射性增强。与正常的GES-1细胞相比，细胞增殖迅速，细胞生长的接触抑制不明显，出现肿瘤生长（图4）。

2.3免疫组织化学染色结果Fltc标记免疫细胞化学染色显示，EBNA1是感染EBV的GES-1细胞。

2.4细胞生长曲线如图3所示。可以看出，EBV感染细胞和c-myc基因转染细胞的数量明显高于空载体转染细胞，随着培养时间的增加，这种差异越来越明显；空载体转染细胞数量与正常GES-1细胞没有显著差异（图3）。