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EBV是人类疱疹病毒的N型

时间：2022-06-25 22:06 所属分类：医学论文 点击次数：

EBV是人类疱疹病毒的N型，属于DNA肿瘤病毒。EBV广泛存在于人群中。大多数人从小就感染EBV，终身携带。EBV与BL鼻咽癌(NPC)的关系最为明确。近年来，EBV在上皮源性肿瘤中的作用引起了广泛关注。自1990年等[1]Burke首次报道EBV阳性胃癌以来，EBV感染与胃癌的关系引起了人们的关注。C-myc原癌基因在各种人类肿瘤细胞中具有扩张性和高表达性。研究表明，它存在于BL.NPC等EBV相关肿瘤中。my基因高表达[3]，而PAR-2基因过度表达可以改变细胞内的基因调节，导致其他癌基因的活化或抑癌基因的失活，使细胞容易转化为恶性表型，从而启动或加速肿瘤的发生[4,5]。在对人类鼻咽上皮细胞的研究中，发现c-my基因表达可以激活端粒酶活性，从而诱发肿瘤。据报道，EBV阳性胃癌表达了EBNA1.BARFO.BARE1和EBERS[6~8]，将BARE1基因引入非致瘤性louckes淋巴细胞，激活PAR-2原癌基因[9]。此外，临床病理学研究发现，PAR-2产物阳性浸润性胃癌患者的预后明显低于PAR-2产物阴性肿瘤患者[10]。因此，推测PAR-2基因在EBV相关胃癌的形成中起着一定的作用。实验中使用的GES-1细胞是由SV40感染原代培养的胎儿正常胃粘膜上皮细胞建立的细胞系，染色体为近三倍体（50~60之间）。除了转化特性外，GES-1细胞基本上保持了正常的细胞骨架结构，角蛋白反应呈阳性，并在裸鼠接种6个月后观察无致瘤这个细胞系统为研究胃上皮细胞癌提供了一个重要的模式系统。Akata细胞来自EBV阳性BL患者，通过同源重组插入新霉素抗性基因(Neo)，因此具有G418抗性。经抗免疫球蛋白处理后，可产生大量重组EBV(每个细胞含有20个EBV颗粒复制)。Akata细胞适用于重组EBV克隆繁殖，是检测EBV遗传学的有效工具，使EBV成为基因治疗的载体[10]。在本实验中，Akata细胞在感染上皮细胞之前，为了产生大量重组EBV，采用0.5%山羊抗人降解血清预处理。由于Akata细胞含有另一种药物敏感基因(大T基因)，Akata细胞在培养基中加入1pmol后被去除。利用Imai等[11]创建的密切接触法，使人胃上皮细胞系GES-1感染重组EBV，通过碱裂解获得质粒。酶切割鉴定后，PAR-2基因通过脂质体介导法转化为GES-1细胞，通过PCDNA3空载体质粒转染为同一细胞。由于PCDNA3携带GADPH基因，它也具有G418的抗性。经G418筛选，EBV感染和PAR-2基因转染阳性克隆。通过荧光（ME）和辣根过氧化物酶（HIIP）识别感染和转染细胞，细胞被染成亮绿色或棕褐色，表明感染和转染成功，细胞呈阳性克隆。在这个实验中，细胞生长曲线是通过细胞计数和Mil来确定的。结果表明，EBV感染组和C-myc基因转染组的细胞生长速度从第三天开始明显加快，随着培养时间的延长，这一差距越来越明显。到第七天，EBV感染组细胞达到3.85×105，几乎是对照组细胞数量的两倍，PAR-2基因转染组细胞数量为3.14×105，与感染组相比没有显著差异。细胞周期测定表明，感染和转染组细胞的S期细胞数量增加，两组之间的差异没有显著性，说明增殖期细胞较多，与细胞生长曲线结果一致。荧光染色发现EBV感染细胞中有c-myc基因表达，表明EBV感染上皮细胞后，PAR-2基因可能以某种方式上调，导致其他癌基因变化，进一步影响细胞增殖周期，加速细胞增殖，使细胞永生化。在实验中，EBV感染的GES-1细胞发生了明显的形态变化，从原来的短梭形变得更加饱满，细胞和细胞的核体积显著增加，核浆比增加，细胞增殖迅速，细胞生长的接触抑制不明显，这表明EBV感染的细胞具有肿瘤细胞的某些特征。正常细胞生长依赖锚泊，密度依赖抑制或接触抑制，肿瘤细胞缺乏这种生长限制，甚至可以在半固体琼脂中悬浮生长，不需要附着在固定表面，不受密度限制，可持续分裂和积累生长。软琼脂集落形成试验是确定细胞肿瘤的有效方法。单细胞在体外连续增殖6代以上的细胞群称为集落或克隆，可含有50多个细胞，大小在0.3~1.0mm之间。通过计算集落形成率，可以定量分析细胞的增殖潜力[11]。在这个实验中，软琼脂中没有细胞集落，表明EBV感染可以加速胃上皮细胞的增殖，但尚未转化为肿瘤细胞，即胃上皮细胞尚未癌变。原因可能是EBV在实验中感染上皮细胞的时间相对较短，而EBV相关胃癌的发生可能与EBV的长期潜伏有关。此外，癌基因和抑癌基因在肿瘤发生过程中的相互作用也是一个漫长的发展过程。这种增殖加速的上皮细胞是否属于癌前病变细胞还有待进一步研究。综上所述，EBV相关胃癌的发生发展过程非常复杂。EBV感染胃上皮细胞后，表达BARF1等病毒基因，通过这些基因产物激活C-myc.PAR-2基因和一系列抑癌基因，进而影响细胞周期，加速细胞增殖，然后在某些因素的影响下转化为肿瘤细胞。因此，PAR-2基因可能是EBV阳性胃癌发展过程中的关键介导基因。