1．方法

(1)将C6细胞分为Q0、Q50、Q100和Q1504组，Q0组加适量二甲亚砜(DMSO，即槲皮素溶剂，每2mlDMEM全培养基中加入1mlDMEMμ低浓度DMSO对细胞生长无影响)处理，Q500、Q100和Q150的槲皮素浓度分别为500、100、150μmol/L。然后将其放入37℃、在5%的CO2孵化器中进行培养。

(2)将三维细胞培养基质胶Matrigel放入冰箱或冰箱2～8℃过夜解冻，吸管轻轻吹打，避免吸入气泡。用高糖DMEM做1∶5稀释后的Matrigel应用于Insert细胞生长面，150～200μl/cm2，37℃作用30min，备用。将饥饿12～24小时后，C6细胞制备细胞悬液、离心弃培养液、PBS洗1～2遍，用含0．1%FBSDMEM配养基重悬细胞，将细胞密度调至5%×105个/厘米2。取200μl细胞悬液加入Transwell上室，取含10%FBS的高糖DMEM培养基500μl加入下室。37℃、5%CO2培养36小时后，用棉签擦去Matrigel和上室内细胞，甲醛固定10分钟。0．1%结晶紫室温下孵化10min，用清水冲洗3次以上。将Transwell小室翻过来，底面朝上，在显微镜下观察拍照，随机选取8个～10个视野进行计数。

(3)将饥饿12～24小时后，C6细胞制备细胞悬液、离心弃培养液、PBS洗1～2遍，用含0．1%FBSDMEM配养基重悬细胞，将细胞密度调至5%×105个/厘米2。取2000个。μl细胞悬液加入Transwell上室，取含10%FBS的高糖DMEM培养基500μ加入下室。37℃、5%CO2培养36小时后，用棉签擦去室内细胞，甲醛固定10分钟。0．1%结晶紫室温孵化10min，用清水冲洗3次以上。将Transwell小房翻过来，底面朝上，在显微镜下观察拍照，随机选择8个～10个视野进行计数。

(4)将培养好的C6胶质瘤细胞培养基半量换液，加入1ml含20μmolLEDU全培养基的最终工作浓度为10μmol/L。在37℃、5%CO2的培养箱中培养24小时后，放弃培养液，加入1ml3．7%甲醛在室温下固定15min，放弃固定液，用3%BSA洗两次。然后加入1ml00．5%TritonX－100室温下孵化20分钟;放弃透明液，用3%BSA洗两次。然后加0。．5mlClick－it反应混合物，室温下避光振荡30min。放弃反应液，用3%BSA洗一次。然后加入1ml1×Hoechst3342反应液室温下避光反应30min。用PBS清洗两次后，在激光共聚焦显微镜下拍照分析，计算其增殖细胞百分比。

(5)室温下收集的悬浮细胞400g离心5min。放弃上清，加入2500g。μL胰酶溶液(A液)，用手指轻轻弹合，室温下反应10min。然后加入2000种。μl胰酶抑制剂与核糖核酸酶混合物(B液)用手指轻轻弹合，室温下反应10min。最后加入200μl冷PI染液(C液)用手指轻轻弹合，4℃避光反应10min。然后在3小时内检测到上流细胞仪。

2．统计学方法

数据以均数±标准差(x±s)表示使用SPSS13．方差齐性检验和单因素方差分析(One－WayANOVA)，P＜0．05是差异，具有统计意义。

3结果

1.槲皮素处理36小时后，Q50、Q100和Q150组的侵袭细胞比例分别为(450．81±7．55)%、(13．63±3．15)%和(4．63±1．12%，与对照组(100%)相比，槲皮素处理组的入侵细胞比率显著降低(P均)＜0．01)槲皮素能显著降低C6胶质瘤细胞的入侵能力，并具有一定的浓度依赖性。与对照组(100%)相比，槲皮素处理12小时后Q50、Q100和Q150的迁移细胞比分别为570．98%±6．84%、33．60%±3．91%和11．79%±3．27%(P均＜0．槲皮素能显著降低C6胶质瘤细胞的迁移能力，并具有一定的浓度依赖性。

2．槲皮素处理24小时后，Q50、Q100和Q150组的增殖细胞百分比分别为211．49%、7．30%和1．与对照组(45%)．与37%相比，其增殖细胞百分比显著降低(P＜0．01)，并表现出一定的浓度依赖性。

4.讨论

研究发现，槲皮素（处理时间为24小时）通过抑制核苷酸类似物Edu与其细胞核混合来抑制C6胶质瘤细胞的增殖，并将其阻断在S期。上述研究证实，槲皮素可以显著抑制大鼠C6胶质瘤细胞的增殖，但阻断其细胞周期的环节存在差异，这可能与操作时的处理时间和细胞生长密切相关；早期研究发现，槲皮素可以阻断G0/G1、S或G2/M的癌细胞;槲皮素阻断细胞在S期或G2/M期依赖于细胞的类型和处理程度。本研究对胶质瘤侵袭和转移的临床研究具有一定的指导意义。综上所述，槲皮素能抑制体外C6胶质瘤细胞的侵袭、迁移和增殖，但其作用机制和临床治疗的应用仍需进一步研究。