绿脓杆菌是一种条件致病菌，是医院感染的主要病原菌之一。得代谢病.血液病和恶性肿瘤病人，以及术后或某些治疗后病人易受细菌感染。这种细菌所致的感染性病变可引起血行扩散，并有菌血症和脓毒症。烧烫伤后感染绿脓杆菌可致人死亡。由于抗菌素的广泛应用和不合理应用，导致了包括绿脓杆菌在内的多种细菌的耐药性问题日益突出。

整合子是与细菌抗性传播相关的基因系统，它通过捕获和整合细菌抗性基因，对抗性基因起着重要作用。整合多个耐药基因位点特异性重组能有效地整合耐药基因，在细菌多重耐药过程中发挥重要作用。

本研究通过对158株铜绿假单胞菌的分析，研究了铜绿假单胞菌整合子与多重耐药的关系。

1物质与方法。

1.1材料

1.1.1菌种来源。

我院临床标本中分离出158株铜绿假单胞菌，为2009年10月至2010年5月。样本来自老年病房(53个).呼吸科病房(49个).普外科(28个).泌尿科(16个)和内分泌科(12个)。分离自痰标本(68).脓汁(42).咽拭子(18).尿样(12)(12)伤口分泌物(10株)，血(8)。试验结果表明，铜绿假单胞菌的检出率较高。带着1型整合子铜绿假单胞菌的样品经序鉴定，作为PCR试验阳性对照。

1.1.2鉴别卡。

全自动化微生物分析仪(VITEK-AMS)采用GNI鉴别卡.GNS药敏卡均从法国Biomerievx公司购买，GNS药敏卡包括氨苄青霉素.庆大霉素.环丙沙星.阿莫西林/克拉维酸.头孢他啶.哌拉西林/他唑巴坦.丁胺卡那.复方新诺明.头孢噻肟.亚胺培南11种抗菌药物的研究。

1.1.3PCR试剂。

TaqDNA聚合酶，4个dNTP混合液，Takara公司收购了DNA分子标准参照物；常用的琼脂糖、溴化乙啶等分子生物学试剂购买了上海生工公司。

1.1.4主要工具。

从法国Biomerievx公司购买了VITEK-AMS自动识别系统；PCR扩增仪.DNA/RNA/proteinanalyzer分析仪和高速低温离心机购买自德国eppendorf公司；PCR电泳仪为北京崇文东方仪器厂产品；PCR电泳仪为宁波新芝科研究有限公司产品。

1.2试验方法。

1.2.1菌株识别。

采用VITEKAMS分析仪GNI细菌鉴别卡对菌种进行鉴定。体外药敏试验：应用GNS检测卡，测定13种抗菌药对158株铜绿假单胞菌的MIC值，其处理方法符合VITEKAMS规范。

1.2.2热解法制备DNA模板。

:以Luria-Bertani液体培养基200r/min振荡8h获得对数生长期的菌株。带着1型整合子铜绿假单胞菌的样品经序鉴定，作为PCR试验阳性对照。

1.2.31型整合子阳性菌的筛选。

利用PCR技术扩增整合子可变区，使上游引物ggcatccaagcagcaagcaagcaagcaagcaagc及下游整合子可变区进行PCR扩增。PCR反应系统DNA100ng.25mmol/LMgCl2.0.4mmol/LdNTP.0.4pmol/L引物和2.5UTaq酶。将PCR反应的循环参数设定为94℃、94℃45秒、55℃45秒、45秒、72℃3分钟，循环35分钟；

1.2.4PCR反应结束后，将产物琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外灯照相。

1.2.5统计处理。

用亚硝酸盐试验，P<0.05有显著差异。统计学软件SPSS10.0。

2结果

2.11类整合基因检测结果。

结果表明，在所有158株铜绿假单胞菌中，有42个菌株表现为I型整合子，占细菌总数的26.6%。类别1:600bp.1000bp.1600bp.1900bp.1600bp.1900bp和2100bp。从细菌质粒DNA上检测到1类整合子的大小和数量，在细菌质粒NDA上的整合子可以划分为5个整合子群。

2.21整合子阳性菌株与耐药的关系。

对整合子1型和阴性两种抗菌药的耐药情况进行比较，并进行统计学分析，结果见表1。

整合子阴性1株对11种抗菌药的敏感性为54.4%(86/158)。整合子1型阳性菌株更容易出现对青霉素喹诺酮、磺胺类药物的耐药性。复方新诺明(100%)与庆大霉素(85.7%)相比，对氨苄西林(90.5%)和庆大霉素(85.7%)均有较高的耐药率(76.7%)。整合子阳性1株对6种药物的耐药率明显高于阴性菌株，P<0.05。

2.31型整合子与多重耐药率的关系。

综合耐药率为62.0%(能承受4种以上抗生素)，其中1类阳性菌株中85.7%(36/42)、20.7%(24/116)阴性菌株的多重耐药率(98/158)。整合子1型阳性菌株的多重耐药率显著高于阴性株，差异有显著性意义(一)，且差异有显著性。

3讨论

整合子是细菌质粒体的遗传学结构，它能捕捉抗药性基因，使细菌对抗生素产生多重耐药性[1][1]，给临床治疗带来很大困难。整合子本身不能移动，但是它通常是转座体的一部分，或者是借助于可移性颗粒在同一种细菌或不同种类细菌之间传播，从而导致细菌耐药性的扩大，这是细菌多重耐药性迅速发展的重要原因。在临床分离菌株中，1型合子最常见，按整合酶分为6组[2]。1类整合子的基本结构由三个部分组成，两端是高度保守的序列，分别称为5’CS和3’CS,5’CS与3’CS之间是可变区，可变区域由一个或多个外来插入基因盒构成[3]。利用集成酶的作用，对外来抗性基因进行位点重组，使抗性基因不断积累，产生抗药性，产生抗药性，产生多种抗药性。已有80多个基因盒被用于1类整合子，大多数为耐药基因盒，编码产物可以使细菌对临床上几乎所有的抗生素耐药性。

绿脓杆菌是医院感染的重要条件致病菌，长期应用激素、免疫抑制剂、免疫抑制剂、执行肿瘤化疗.放疗等导致患者免疫功能低下，及术后患者术后或某些治疗措施后容易引起本菌感染，由于这种菌株经常具有多重耐药特性，所以它引起的感染难治，死亡率高。近几年来证实整合子介导的多重耐药基因也是铜绿假单胞菌多重耐药的重要原因之一。

结果表明，铜绿假单胞菌在呼吸系统中感染率最高，达54.5%(86/158)，大部分文献报道都是如此[5]造成这种现象的原因，很可能是铜绿脓杆菌易在呼吸道中形成，而且是因为气管插管.流感病毒感染及各种炎症等因素造成呼吸道粘膜损伤，在鞭毛或蛋白酶的作用下，病菌很容易迁移，粘附是有关系的。创伤创面也更容易受到伤害，检出率为32.9%(52/158)，居第二位，与其存在广泛性和医院环境隔离消毒程度有关。临床试验证实，我院病人分离的绿脓杆菌对多种抗生素均有较高的耐药性，特别是显示了对青霉素类.头孢菌素类.氨基糖甙类.单环β-内酰胺类和磺胺类的多重耐药，更是不容忽视。