1、细胞培养

结肠癌细胞Caco2、HT29、HCT116、SW480、SW620、SW1116、Lovo都是从ATCC购买的，并由上海消化外科研究所传代保存。Lovo采用含10的Lovo。％F-12K培养胎牛血清；CaCo2、HT29、HCT116、SW480、SW620、SW1116均使用100％将RPMI1640培养液置于37℃、5％在CO2的培养箱中，以1∶2至1∶4的比例传代培养。

二、方法

1.样品收集及免疫组化染色:结肠直肠肿瘤标本取自上海微创外科临床医学中心手术室。切除手术标本后，用生理盐水清洗，打开肠腔，切除肿瘤表面坏死和炎性肉芽组织；取肿瘤中心部位和距肿瘤5cm以上的正常肠粘膜全层组织，切成1cm块，放入样本管中。4%甲醛溶液完全固定后，组织标本制成蜡块、切片和贴片。然后使用链霉素亲和素-过氧化酶复合物（SP）免疫组化染色，DAB显色。TMPRS4多克隆抗体从美国Proteintech公司购买，1∶50稀释。

2.半定量RT-PCR：Trizol试剂（Invitrogen，美国)提取细胞总RNA。RNA浓度测定在分光光度计260nm处，用逆转录试剂盒测定RNA完整性，（Takara，日本)逆转录CDNA合成ABIPrismSDS7000。上海吉玛生物有限公司合成以下引物：TMPRS4上游引物5′-TCCAAGGACCGATCCACACT-3′，下游引物5′-AAGTTGTCGAAACAGGCAGAG-3′；GGAPDH上游引物5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAA-3′，下游引物5′-TGTCATACCAGGAAATGAGC-3′。PCR仪中的CDNA(AppliedBiosystems，美国)反应，50℃2min、95℃10min、95℃15s、60℃30s、72℃30s，共35个循环；然后，72℃10min，扩增产品10分钟，％在琼脂糖凝胶中，130V、在30分钟的条件下，电泳并在紫外线下拍照，成像保存。

3.Western印迹法：细胞在10cm培养皿中（Corning，美国)中生长融合约90%时，PBS清洗两次后加入300%μLRIPA，冰上30min裂解充分后，煮10min，然后13000r/min离心5min。取清液，BCA法测量蛋白质浓度。每个孔的样品为100μg，加入5×上样缓冲液、去离子水与总体积一致后变性电泳(积胶80V，分离胶120V)，半干转膜(15V)70min后脱脂牛奶室温封闭2h，4℃下抗(兔抗人TMPRS4多抗，112831-AP，Proteintech，美国，1∶600稀释)过夜孵化。TBST洗膜3次后，加入一定比例稀释的相应二抗室温孵化1h，TBST洗膜2次，PBS洗膜1次后荧光发光。

4.siRNA瞬时转染：细胞生长到70%融合时胰酶消化，计数后按每孔33×105细胞铺6孔板，过夜。24小时后，根据Lipofectamine2000（Invitrogen，细胞转染是由上海吉玛生物有限公司设计合成的TMRPS4-siRNA序列:5′-AAGUUGUCGAAACAGGCAGAGAACC-3′(si组)。只转染Lipo2000的细胞是空白对照组，转染阴性对照序列的细胞是阴性对照组(NC组)。转染48小时后，用Trizol试剂提取总RNA，72小时提取总蛋白质。

5.CCK-8测量细胞增殖：SW480细胞计数后，铺设96孔板，每孔100个；设置干扰组、阴性对照组和空白对照组，每组6个复孔。在第0位、24、48、72、96、120h分别在各孔中加入CCK-8试剂（cellcountingkit-8，Dojindo,日本）10μL，37℃孵育2.5h，酶标仪测量每个孔的吸光值为450nm。细胞生长曲线以时间为横坐标，吸光值为纵坐标。

6.AnnexinⅤ/PI流检细胞凋亡：转染48小时后收集细胞，取100μL细胞悬液(1)×106个/mL）流管，用PBS洗一次，离心后加300μL与缓冲液混合，混合均匀，再加入5μL的AnnexinⅤ-FITC和5μL的PI，孵化15分钟后，使用流式细胞仪（BD，美国)上机检测。

7.划痕试验:6孔板转染。细胞铺好后，用无菌枪头每孔笔直划线，PBS清洗3次，加入无血清培养液培养箱孵化。24小时后，在显微镜下随机选择视野观察摄像头。

8.transwell迁移试验：取转染24小时后细胞，无血清RPMI1640培养液重悬后计数，调至最终密度为5×105个/mL。每孔加入9000孔板μL含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液，然后放入transwelll小室（Corning，美国)，小室内加200μL细胞悬液(105个细胞)。培养箱孵化24小时后取出，棉签擦去室内细胞，甲醇固定小室外穿细胞10min，1%结晶紫染色10min，PBS清洗3次后，在显微镜下观察摄影。